trừu tượng

Để nghiên cứu và phân tích các chính sách gây apoptosis cơ bạn dạng trong số tế bào ung tlỗi vú, staurosporine đã có được sử dụng như một kích thích apoptotic trong những cái tế bào ung thỏng vú MCF-7 với T47D. Staurosporine tạo ra tăng liều cùng dựa vào thời gian vào phân mảnh DNA đã biết thành hủy bỏ do z-VAD-fmk. Các tế bào MCF-7 không biểu lộ caspase-3, cho thấy thêm sự phân mhình họa DNA xẩy ra vào trường hòa hợp không có caspase-3 cùng các caspase khác có thể tương quan. Staurosporine gây ra chuyển động DEVDase trong những tế bào T47D cho thấy sự tmê say gia của caspase-3 cùng / hoặc caspase-7, nhưng mà không có chuyển động DEVDase trong những tế bào MCF-7, rất có thể đào thải sự tđắm say gia của caspase-7. Tuy nhiên, staurosporine gây ra sự phân cắt của pro-caspase-6 trong số tế bào MCF-7, tuy vậy không hẳn trong các tế bào T47D. Sự phân bóc PARP phụ thuộc Caspase được vạc hiện tại trong số tế bào MCF-7 dịp 3 giờ, trong những khi chỉ phân tách PARPhường một phần được phát hiện tại trong những tế bào T47D cùng tiếp đến chỉ với sau 24 tiếng. Ngoài ra, staurosporine đang dẫn đến sự việc xây đắp cytochrom c vào tầm khoảng 2 giờ trong số tế bào MCF-7 và 6 tiếng trong những tế bào T47D. Trong khi, sự bớt phụ thuộc thời hạn cùng hòa bình caspase của điện núm màng vào ty thể đã làm được quan gần kề thấy; mở ra sau khoản thời gian desgin cytochrom c . Sự chuyển vị của Bax từ bỏ cytosol thanh lịch ty thể đã có quan lại giáp thấy ở hai nhiều loại tế bào và điều này vẫn xây cất cytochrom c vào cả hai tế bào T47D và MCF-7. Các sự kiện apoptotic trong cả nhì loại tế bào khác biệt theo thời gian, liên quan tới việc kích hoạt những caspase khác nhau với chuyển đổi ty thể.

Bạn đang xem: Apoptotic là gì


Chủ yếu

Apoptosis là 1 quá trình thiết yếu trong cả cải tiến và phát triển nhiều tế bào cùng gia hạn cân đối nội môi tế bào. Nhiều hơn, sự thua cuộc của các tế bào bị hư sợ phải trải qua quy trình apoptosis đóng góp thêm phần vào sự tiến triển của ung tlỗi bởi vì nó chất nhận được sự tồn tại của những tế bào bị hư hỏng DNA. Do kia, siêu quan tâm nhằm đọc tuyến đường truyền biểu thị apoptotic trong số loại ung thỏng khác biệt. Apoptosis được xác minh sắc thái vị sự co rút tế bào, sự chảy máu màng, dừng tụ chromatin và có mặt những ban ngành apoptotic. Trung trọng tâm của quá trình apoptotic là một trong những bọn họ protease cystein được gọi là caspase, là tác nhân đặc biệt quan trọng của quá trình chết tế bào này. Caspase mãi sau trong tế bào dưới dạng các pro-enzyme không chuyển động rất có thể được kích hoạt bằng phương pháp xử trí xúc tác auto hoặc được kích hoạt vày một caspase khác (Earnshaw et al, 1999). Các protease này có thể được phân các loại thành nhì nhóm: caspase 'initator', ví dụ caspase-8 cùng -9, có prodomains dài trên NH 2 -termini và có tác dụng từ phân tách bóc trên oligomeisation, và 'effector' caspase -3, -6 cùng -7 tất cả các prodomain ngắn với rất có thể được kích hoạt vì các caspase khởi tạo nên hoặc bởi vì những caspase kích hoạt (Thornberry và Lazebnik, 1998). Sau khi được kích hoạt bởi vì những kích yêu thích apoptotic, caspase góp phần vào sự thay đổi sắc thái và sinc hóa của apoptosis bằng cách xúc tác quá trình phân giải protein với vô hiệu hóa hóa những protein cấu tạo với điều tiết đặc biệt quan trọng trong tế bào nlỗi, poly-ADP-ribose polymerase (PARP), gelsin nhân tố phân mhình họa 45 kDa (DFF45) (Nunez et al, 1998).


Họ Bcl-2 tất cả các protein phòng (Bcl-2, Bcl-x L, Mcl-1) với pro-apoptotic (Bax, Bad, Bid) cũng rất đặc biệt quan trọng trong bài toán cân bằng sự chết của tế bào. Các member trong gia đình Bcl-2 có tác dụng sinh ra các chất có tác dụng mờ đồng loại với dị vừa lòng tử với phần trăm protein kháng cùng apoptotic có thể ra quyết định số phận của tế bào (Reed, 1998). Những protein này rất có thể là màng liên kết hoặc tế bào. Bcl-2 đã làm được chứng tỏ là được định vị vào lưới nội chất, màng ty thể với vỏ phân tử nhân (Krajewski et al, 1993), trong khi các member khác như Bax với thầu chủ yếu là tế bào học tập. Tuy nhiên, Khi khởi phát apoptosis, trong nước hóa một số trong những member mái ấm gia đình Bcl-2 đổi khác. lấy một ví dụ, Bax đã được chứng minh là đưa từ cytosol lịch sự màng ty thể sau khoản thời gian điều trị bằng một kích ưa thích apoptotic (Zhang et al, 1998), và tạo ra sự giải pngóng cytochrom c với kích hoạt caspase tiếp nối. Do sự đa dạng mẫu mã trong chức năng của bọn chúng, những protein này chế tác thành một điểm thay đổi quan trọng vào tuyến đường apoptotic.


Một sự thay đổi vào tính năng của ty thể đã có được minh chứng là đóng góp một phương châm đặc trưng trong giai đoạn ảnh hưởng của tuyến đường apoptotic. Việc giảm năng lượng điện cầm màng vào ty thể (m) với giải pngóng protein cytochrom c của ty thể hay được quan liêu tiếp giáp thấy trong quy trình apoptosis (Zamzamày et al, 1995; Liu et al, 1996). Khi gây nên apoptosis cytochrom c được giải pđợi tự không khí giữa màng tế bào vào tế bào hóa học khu vực nó dẫn cho kích hoạt caspase cùng chết tế bào tiếp nối (Liu et al, 1996). Sự phá vỡ vạc tiềm năng xuyên màng của ty thể biết tới qua trung gian vì vấn đề mở 1 kênh dẫn Khủng được Điện thoại tư vấn là nang lông chuyển tiếp thnóng qua ti thể (PTP) (Zamzangươi et al, 1996). Các nghiên cứu đang cho là việc chế tạo cytochrom c xẩy ra vào trường vừa lòng không tồn tại hoặc trước việc cách quãng ΔΨm (Bossy-Wetzel et al, 1998; Goldstein et al, 2000), tuy vậy bề ngoài đúng mực của bài toán kiến tạo cytochrom c vẫn chưa chắc chắn rằng. Tác dụng kháng apoptotic của Bcl-2 và Bcl-x L đã có được minh chứng là gồm liên quan đến sự việc ngăn chặn sự giải pchờ cytochrom c với mất whereasm trong lúc Bax prooptotic hoàn toàn có thể gây ra những biến đổi ty thể này (Decaudin et al, 1997; Yang et al, 1997 ; Jurgensmeier et al, 1998).


Thđọng trường đoản cú của những sự kiện apoptotic giống như cực kỳ khác biệt tùy thuộc vào căn cơ tế bào cùng kích thích apoptotic. Do kia, điều quan trọng là bắt buộc gọi những yếu tắc phân tử của cỗ máy chết của tế bào để cung ứng bài toán tùy chỉnh can thiệp trị liệu tương thích. Thật vậy, các phân tích vứt bỏ caspase sẽ chỉ ra rằng không hẳn toàn bộ những caspase phần đông cần thiết đến quy trình apoptosis (Zheng et al, 1999). Caspase-3 đã có minh chứng là vào vai trò trung trung ương trong những sự kiện apoptotic đặc biệt như sự phân mhình họa DNA với sự bị chảy máu màng, và loài chuột caspase-3 null chết hàng năm cùng hiển thị hết sức tế bào (Woo et al, 1998). Các tế bào ung thỏng vú MCF-7 cũng thiếu hụt protein caspase-3, tuy vậy bọn chúng vẫn đáp ứng nhu cầu với khá nhiều kích ưng ý apoptotic cho biết thêm sự dư thừa tính năng vào chúng ta caspase (Janicke et al, 1998a). Nghiên cứu này nhằm mục đích mục tiêu phân tích các hình thức truyền biểu hiện apoptotic nội bào ngơi nghỉ T47D (caspase-3 dương tính) và MCF-7 (caspase-3 âm tính) để đáp ứng với chất ức chế protein kinase nói chung và kích thích apoptotic, staurosporine (STS). Chúng tôi thấy rằng, trong hai một số loại kăn năn u rắn giống như này, sự biệt lập sống thọ trong các chính sách nhưng chúng trải qua quá trình apoptosis. Kết quả của chúng tôi cho biết cơ chế bị tiêu diệt tế bào khác hoàn toàn về khía cạnh hễ học tập với các sự kiện xẩy ra sớm rộng trong những tế bào MCF-7, đối với những tế bào T47D. Bên cạnh đó, điều đó liên quan tới việc tạo cytochrom c, có tác dụng giảm tiềm năng màng trong ty thể (ΔΨm) và kích hoạt những cẩn thận khác nhau của loại thác caspase.


Vật liệu với pmùi hương pháp

Nguyên vật dụng liệu

Staurosporine (STS) với z-VAD-fmk tới từ chúng tôi hóa sinch học (Nottingham mê, Vương quốc Anh). E. Coli . DNA polymerase 1 cùng tất cả các môi trường thiên nhiên nuôi ghép và tiết tkhô nóng được lấy tự Gibteo BRL (Paisley, Vương quốc Anh). Kháng thể đơn cái ngăn chặn lại Bcl-2, kháng thể nhiều loại kháng Bcl-x L và phòng thể nhiều cái cùng với caspase-6 được lấy tự Santa Cruz Biotech Inc., (California, Hoa Kỳ). Kháng thể nhiều chiếc của thỏ đối với Bax được download trường đoản cú TCS Biologicals Ltd., (Buckingsay mê, UK). Kháng thể PARP, Bak và cytochrom c tới từ Pharmingene (Oxford, Vương quốc Anh). Hệ thống khảo nghiệm CaspACE, Colorimetric tới từ Promega, (Southampton, UK). Bộ luật pháp ELISA bị tiêu diệt tế bào và viên thuốc cocktail protease là của Boehringer Mannheim, (East Sussex, UK). Hệ thống ECL được đem từ Amerstê mê, (Buckinghamshire, Vương quốc Anh).

Nuôi ghép tế bào

Các mẫu tế bào ung thư vú ngơi nghỉ fan T47D (ung tlỗi biểu tế bào ống) cùng MCF-7 (adenocarcinoma) được bảo trì vào Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) được bổ sung cập nhật 10% (v v −1 ) máu tkhô hanh tnhị nhi (FCS) cùng 2 m m glutamine. Các tế bào được duy trì ngơi nghỉ 37 ° C trong môi trường không khí ẩm / CO 2 (19: 1). Các tế bào được ủ cùng với môi trường thiên nhiên 1% FCS DMEM vào thời gian nghiên cứu cho những lần được chỉ định.


Dịch niông xã tại vị trí (ISNT)

Các tế bào được ủ cùng với staurosporine cho những thời khắc không giống nhau Khi bao gồm hoặc không có z-VAD-fmk. Các tế bào dính nối cùng bóc tránh được gộp lại cùng được cố định và thắt chặt vào 1% paraformaldehyd cùng được thnóng vào ethanol 70% sinh sống −20 ° C. Các tế bào sau đó được rửa vào PBS cùng ủ làm việc ánh nắng mặt trời chống trong 4 giờ đồng hồ với cỗ đệm dịch niông chồng (50 m M TRIS, 10 μg ml −1 albumin huyết tkhô nóng trườn (BSA), 2, 5 m M MgCl 2. 6H 2 O, 10 m M -mercaptoethanol) đựng E. Coli DNA polymerase (1 đối kháng vị), 0, 2 n M biotin-dUTPhường và 0, 2 n M mỗi dATPhường, dGTPhường cùng dCTPhường. Các mẫu mã được cọ và phân phối lại vào hỗn hợp nhuộm (NaCl 600 m, natri citrat 60 m, Triton X-100 0, 1%, sữa khô không béo 5% (Marvel)) bổ sung 2, 5 μg ml −1 avidin-FITC. Các mẫu tiếp nối được cọ cùng phân tích bằng Flow Cytometry. Các phần mẫu của một vài mẫu khăng khăng (100 μl) được nhuộm bởi 1 mlg ml −1 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), cytospun bên trên các phiến kính và hiển thị dưới kính hiển vi huỳnh quang đãng bằng Phần mượt IP Lab Spectrum (Signal Analytics, infobandarpkr.comnna, VA, Hoa Kỳ) mang đến hình hài phân tử nhân apoptotic.

Xem thêm: Khối Lượng Chất Rắn Khan Khi Cô Cạn Dung Dịch Là Gì, Cô Cạn Dung Dịch Nghĩa Là Gì

ELISA phân mảnh DNA (Boehringer Mannheim)

Xét nghiệm này đo những đoạn DNA links cùng với tế bào chất (mono- cùng oligonucleosome) được tạo thành vào quá trình apoptosis (Boehringer Mannheim). Sự có tác dụng giàu của những truyền nhiễm sắc đẹp thể trong tế bào chất của những tế bào được chữa bệnh được biểu lộ bởi chạm màn hình vội vàng trong apoptosis đối với các đối chứng không được chữa bệnh. Các tế bào (1 × 10 5 ) được ủ với cùng một μ M STS, được cọ trong PBS và sau đó được lọc vào cỗ đệm ly giải vào 1/2 tiếng. Chất tuyệt vời (tinh chiết tế bào chất) đã có phục sinh với xét nghiệm được tiến hành theo giao thức ở trong phòng cung ứng.

Xét nghiệm Prúc lục-V-FITC (BioSource International Inc)

Các tế bào (5 × 10 5 ) được xử trí với 1 μ M STS cho những lần chỉ định. Các tế bào kết dán với tách bóc rời được gộp lại, cọ sạch mát cùng kế tiếp được nối lại vào cỗ đệm liên kết (hỗn hợp đệm 10 m M HEPES / NaOH, pH 7.4, 140 m M NaCl, 2, 5 m M CaCl 2 ) cùng kháng thể annexin-V-FITC (5 μl) và ủ vào 10 phút ít nghỉ ngơi ánh nắng mặt trời phòng. Các tế bào được rửa cùng hồi lưu vào cỗ đệm link có đựng propidium iodide (PI) (10 μl) để cho độ đậm đặc sau cuối là một trong những μg ml 1 PI trước khi đối chiếu bằng phnghiền đo tế bào học tập. Phân tích Bivariant của FITC-huỳnh quang (FL-1) cùng PI-huỳnh quang (FL-3) đã cho các quần thể tế bào không giống nhau trong đó FITC −ve sầu cùng PI ve được chỉ định và hướng dẫn là các tế bào khả thi; FITC + ve sầu cùng PI có vẻ bên ngoài hình là các tế bào apoptotic, với FITC + ve sầu với PI + ve là những tế bào apoptotic hoặc hoại tử muộn.

Xét nghiệm chuyển động Caspase (Promega)

Hệ thống khảo nghiệm CaspACE được thực hiện nhằm phát hiện nay chuyển động DEVDase (caspase-3/7). Các tế bào được giải pháp xử lý với cùng 1 μ M STS cùng được thanh lọc trong bộ đệm ly giải từ bỏ bộ cách thức. Hàm lượng protein đã được xác minh với lysates được ủ cùng với Ac-DEVD-pNA vào 4 tiếng ngơi nghỉ ánh nắng mặt trời chống. Sản phẩm bội nghịch ứng được phân phát hiện nay nghỉ ngơi bước sóng 405nm bằng cách sử dụng đầu hiểu đĩa tự động hóa của năm 2001 (Công rứa của Lab Lab, Vương quốc Anh).

Phân tích tế bào học tập của điện nạm màng ty thể (m)

Để đo m, các tế bào (5 × 10 5 ) được ủ cùng với 40 n M 3, 3-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC 6 (3)) vào đôi mươi phút nghỉ ngơi 37 ° C. Như một biện pháp kiểm soát điều hành tích cực và lành mạnh nhằm cho biết sự suy bớt hoàn toàn m, tín đồ bóc rời ty thể, carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP sống 50 M) đã làm được thực hiện. Propidium Iodide (PI) đã có cung ứng trước lúc phân tích FACS nlỗi là một thước đo năng lực sinh sống của tế bào. Độ huỳnh quang của tổng quần thể tế bào được đo bởi DiOC 6 (3) ở huỳnh quang quẻ xanh (FL-1) và PI làm việc huỳnh quang quẻ đỏ (FL-3) bằng FACScan bởi ứng dụng CellQuest (Becton Dickinson).

Tây phương

Các tế bào được giải pháp xử lý với cùng 1 μ M STS trong các khoảng chừng thời gian không giống nhau, tiếp nối được rửa nội địa đá lạnh PBS cùng được thanh lọc trong trăng tròn phút trên nước đá vào dung dịch đệm (50 m M Tris.HCl, pH 7.4, 150 m M NaCl, 1% (v v 1 ) NP-40, 0, 625% natri deoxycholate, 1 m M NaF, 1 m M Na 3 VO 4, 1 viên cocktail protease (Boehringer Mannheim)). Lượng bằng nhau của tổng cộng protein (30 μg) đã bị 14% (protein mái ấm gia đình Bcl-2, cytochrom c với cytochrom c oxyase), 8% (Poly ADP-Ribose Polymerase (PARP)) hoặc 10% (caspase-6) SDS CấmPAGE tiếp nối chuyển phương thơm Tây vào màng PVDF. Màng được ủ với chống thể cản lại Bcl-2, Bax, Bak cùng Bcl-x L, PARP, caspase-6 hoặc cytochrom c và được vạc hiện nay với kháng thể phối kết hợp HRPhường máy cấp sệt hiệu của loại. Protein được phạt hiện tại bởi khối hệ thống ECL (Amersmê man, UK).

Các kết quả

Staurosporine tạo ra apoptosis trong các tế bào ung thỏng vú sinh hoạt tín đồ T47D cùng MCF-7

Các phân tích về apoptosis, được xác minh bởi sự phân mhình họa DNA (ISNT), sẽ chứng tỏ rằng các tế bào T47D cùng MCF-7, Lúc xúc tiếp cùng với STS (0, 2 Nott1 μ M), cho biết sự tăng thêm nhờ vào vào mật độ vào apoptosis, cùng với công dụng tối nhiều cho tất cả nhị tế bào tại 1 μ M STS (tài liệu ko được hiển thị). Apoptosis cũng là một trong những quy trình phụ thuộc vào thời hạn. lúc xúc tiếp với cùng một μ M STS, sự gia tăng đáng chú ý các tế bào hiển thị sự phân mhình họa DNA là rõ ràng vào khoảng 14 giờ trong những tế bào T47D, dẫu vậy đều biến hóa apoptotic đã có được phạt hiện tại nhanh nhất là 4 giờ trong các tế bào MCF-7 (Hình 1A). Chúng tôi đang kiểm tra thêm sự phân mảnh DNA bằng ELISA chết tế bào. Các công dụng được trình diễn vào Hình 1B cho biết sự ngày càng tăng phụ thuộc vào vào thời gian với sự hiện diện của các 1-1 nhân cùng oligo-nucleosome giống như nlỗi đang thấy với ISNT ở 2 loại tế bào, cùng với các tế bào MCF-7 thể hiện cường độ apoptosis cao hơn nữa. Hiệu ứng apoptotic đã có được xác nhận vị hình dáng phân tử nhân (Hình 1C), với cả nhị loại tế bào cho thấy sự ngưng tụ phân tử nhân cùng truyền nhiễm dung nhan thể bé dại rộng dẫn tới việc sinh ra hình lưỡi liềm bao quanh nước ngoài vi của hạt nhân. Tuy nhiên, những tế bào T47D hiển thị sự có mặt khung người apoptotic tuy vậy vấn đề này không tồn tại trong số tế bào MCF-7 (Hình 1C). Ngoài ra, sự đổi khác màng huyết tương, chẳng hạn như tiếp xúc cùng với dư lượng phosphatidyl-serine (PS) với bề mặt phía bên ngoài của màng plasma là ví dụ vào quá trình apoptosis gây ra do STS. STS tạo ra sự tăng thêm liên kết của annexin-V trong những tế bào MCF-7 sau 4 giờ khám chữa và liên tục tăng, tuy nhiên điều đó xảy ra kế tiếp trong các tế bào T47D trong những số ấy links annexin-V đáng chú ý đã có được 12 tiếng sau 1 μ M STS (Hình 2 ). Không bao gồm đổi khác làm sao trong liên kết annexin-V được phạt hiện tại trước 12 tiếng trong ô T47D (tài liệu không được hiển thị). Như vậy chứng minh rằng sự biến đổi màng plasma hoàn toàn có thể xẩy ra tức thì trước khi phân mhình họa DNA trong các tế bào T47D, tuy nhiên, trong số tế bào MCF-7, hầu hết biến đổi này chắc là xảy ra bên cạnh đó.

Xem thêm: Net Off Là Gì ? Cách Tính Giá Nét, Giá Gross Chính Xác 100% Cho Doanh Nghiệp

*

Staurosporine gây nên apoptosis trong những tế bào ung thỏng vú làm việc bạn T47D cùng MCF-7. ( A ) Các tế bào được xử trí với cùng một μ M STS cho các lần được chỉ định với apoptosis được khẳng định bởi phân mhình ảnh DNA (ISNT) trên các tế bào cố định cùng được thnóng. Dữ liệu được trình diễn theo xác suất phân mhình họa DNA: các thanh lỗi biểu thị cực hiếm vừa phải ± sem của ba thử nghiệm độc lập. ( B ) Các tế bào được xử trí với 1 μ M STS cho các lần được hướng đẫn, lysates được đối chiếu bằng ELISA theo phía dẫn ở trong nhà thêm vào. Cảm ứng vội trong apoptosis được biểu lộ bằng con số phức tạp DNA-histone tế bào hóa học trong những tế bào được điều trị so với những đối chứng ko được chữa bệnh. Các tkhô hanh lỗi thay mặt cho quý giá trung bình ± sem của bố xem sét chủ quyền trong các số đó * biểu hiện nấc tăng apoptosis đáng kể về khía cạnh những thống kê so với kiểm soát điều hành ko được chữa bệnh (0 h), (ANOVA: F = 5, 44, Phường. 1 DAPI. Các tế bào tiếp đến được đối chiếu bằng kính hiển vi huỳnh quang đãng.